QUANTOM Tx™微生物細胞計數(shù)儀助力快速菌群定量分析

1 引言

細菌定量是醫(yī)療健康、農業(yè)生產、食品加工及工業(yè)領域的基礎檢測項目。無論是益生菌中活性干酪乳桿菌的精準計量、疫苗中滅活霍亂弧菌的定量檢測、污水處理用硫氧化菌的效能評估，抑或土壤污染監(jiān)測中的常規(guī)菌群分析，乃至實驗室標準菌懸液的濃度測定，細菌計數(shù)均是關鍵步驟。本文對比三種傳統(tǒng)細菌檢測方法，并介紹一種快速自動化定量解決方案。

1.1 菌落計數(shù)法

細菌定量的方法之一是統(tǒng)計菌落形成單位（CFUs）。這種廣泛使用的方法操作簡單，能夠很好地反映細胞的活性情況，并且對低濃度細菌也具有很高的靈敏度。然而，該方法依賴于培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，并且僅限于可培養(yǎng)的細菌，這使得存活但不可培養(yǎng)（VBNC）菌株無法被檢測。另一個主要缺點是該方法通常需要數(shù)天時間才能得到結果，而這些結果也只是估算值。一塊菌落可能來源于一個細胞，也可能來源于上千個細胞。此外，樣本制備過程因技術人員的操作差異以及樣本條件的不同而可能存在變動。對于諸如食品或水污染等需要快速響應的時效性問題而言，這種耗時的特點是一個顯著的缺陷。

1.2 血球計數(shù)板法

采用Petroff-Hausser或Levy等專用計數(shù)板直接顯微計數(shù)，這種細胞計數(shù)的“金標準"是一種相對快速、簡單的方法，可獲得結果。然而，該方法操作繁瑣，并且容易受到操作者之間差異的影響。細菌體積微小，不僅某些物種即使在顯微鏡下難以觀察，同時還會導致細菌在計數(shù)腔內移動，并分布于不同的焦平面上，從而難以評估和控制每次細胞復制時計數(shù)的準確性。

1.3 流式細胞儀

流式細胞儀被認為是確定總細胞數(shù)和活細胞數(shù)最為準確的方法之一。然而，這種方法中操作儀器和分析數(shù)據(jù)都需要廣泛的培訓。與菌落計數(shù)類似，流式細胞儀的一個顯著局限性是無法區(qū)分單個細胞和細胞團。每個粒子均記錄為單一事件，因此，聚集的球菌或鏈狀的桿菌無法被識別為單個細胞。

1.4 QUANTOM Tx™微生物細胞計數(shù)儀

QUANTOM Tx微生物細胞計數(shù)儀是一款基于圖像的自動化細胞計數(shù)設備，能夠在數(shù)分鐘內識別并計數(shù)單個細菌細胞。QUANTOM Tx可自動對熒光染色的細胞進行聚焦、成像和多圖像分析，以高靈敏度和高精確度檢測細菌細胞。其先進的細胞檢測與解聚算法，即使在最緊密的細胞聚集體中，也能準確識別單個細菌細胞。通過使用兩種不同的染料，QUANTOM Tx可以分別計數(shù)總細胞數(shù)或活細胞數(shù)。染色后的細胞與QUANTOM細胞加載緩沖液I混合后，被加載到QUANTOM M50細胞計數(shù)載片中，并使用QUANTOM離心機進行離心處理，從而將細胞固定并均勻分布在單一焦平面上，確保精確的細胞檢測。計數(shù)結果和圖像可在計數(shù)完成后立即查看和保存。

用QUANTOM Tx™微生物細胞計數(shù)儀計數(shù)

2 QUANTOM Tx對標準微球計數(shù)的精準測定

通過計數(shù)已知濃度的標準熒光微球，驗證了QUANTOM Tx的計數(shù)準確性。實驗中，微球經系列稀釋后與QUANTOM細胞加載緩沖液I混合，并加載到QUANTOM M50細胞計數(shù)載片中。載片在QUANTOM離心機中以300×g（RCF）離心10分鐘，以確保微球均勻分布，隨后使用以下參數(shù)在QUANTOM Tx上進行計數(shù)：LED設置為“Bead（微球）"、粒徑范圍為1-50μm、檢測靈敏度為0、解聚等級為7、圓度為30%。所有計數(shù)均進行了三次重復。正如圖1所示，QUANTOM Tx的計數(shù)結果與微球的理論濃度呈現(xiàn)出高度相關性（R2 = 0.9997）。

圖1. 已知標準微球濃度與QUANTOM Tx結果之間的相關性

3 與流式細胞儀和血球計數(shù)板的準確性及變異性比較

為了比較QUANTOM Tx與流式細胞儀和血球計數(shù)板的計數(shù)準確性，對大腸桿菌進行了三次重復的系列稀釋計數(shù)。對于流式細胞儀，使用噻唑橙（Thiazol Orange）對細胞進行染色，并使用FACSCalibur流式細胞儀（BD Biosciences）進行計數(shù)，同時加入標準微球以幫助確定細胞濃度。對于血球計數(shù)板，細胞被加載到Petroff-Hausser計數(shù)板（20 μm，Hausser Scientific）中，并通過CELENA S數(shù)字成像系統(tǒng)（Logos Biosystems）使用TC PlanAchro 20倍物鏡進行成像，計數(shù)了Neubauer計數(shù)網格中的五個小格。對于QUANTOM Tx，細胞使用QUANTOM總染色染料進行染色，并使用以下參數(shù)進行計數(shù)：LED強度=5，粒徑范圍=0.3-50 μm，檢測靈敏度=0，解聚等級=0，圓度=0%。結果顯示，總細胞濃度的計數(shù)結果之間沒有顯著差異，但隨著細胞濃度的增加，血球計數(shù)板的計數(shù)結果變異性較高，而QUANTOM Tx和流式細胞儀的結果則更加一致（圖2）。

圖2. QUANTOM Tx、流式細胞儀和血球計數(shù)板的計數(shù)結果比較。

4 可調節(jié)的檢測方案適用于各種形態(tài)和排列方式的細菌細胞

為了展示QUANTOM Tx的多功能性，不同種類的細菌使用QUANTOM總染色染料進行染色，并通過QUANTOM Tx進行計數(shù)。QUANTOM Tx能夠在每次計數(shù)中自動捕獲、分析并標注多達20張高分辨率圖像，使得研究人員可以輕松地通過視覺驗證每次計數(shù)的準確性。以干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）為例，使用以下參數(shù)進行計數(shù)：LED強度=5，粒徑范圍=1-50 μm，檢測靈敏度=0，解聚等級=7，圓度=0。對于巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium），使用的參數(shù)為：LED強度=5，粒徑范圍=1-50 μm，檢測靈敏度=3，解聚等級=10，圓度=0。更多細菌種類及其對應的參數(shù)設置可參見：goo.gl/ixr8kr。如圖3所示，QUANTOM Tx利用解聚功能能夠在緊密排列的桿菌鏈中精準分辨出單個細胞。

圖3. 使用QUANTOM Tx的解聚功能檢測桿菌鏈中的單個細胞。左圖為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei），右圖為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium），解聚等級分別設置為7和10。

5 結論

細菌是一類極其多樣化的生物，具有多種多樣的形態(tài)、大小和排列方式，這使得自動化細胞計數(shù)成為一項充滿挑戰(zhàn)的任務。傳統(tǒng)的菌落計數(shù)方法不僅耗時，而且其結果充其量只能算作一種不可靠的估算。即使是流式細胞儀，也會將每個粒子（無論是單個細胞還是聚集體）都記錄為一個單獨的事件。血球計數(shù)板操作耗時，并且容易受到操作者間變異的影響。QUANTOM Tx微生物細胞計數(shù)儀能夠高效、準確且快速地對各種形態(tài)和排列方式的細菌進行定量分析。這使得QUANTOM Tx成為一種重要且必需的工具，可用于樣本中細菌群體的即時、實時評估。

使用QUANTOM Tx測試的部分細菌列表